Crear ambientes a utilizar
#ambiente para ejecutar fastqc
conda create -c bioconda -c conda-forge fastqc -n fastqc -y
#Ambiente para fastp y spades
conda create -n Genomics -y
#Instalar paquetes en el ambiente
conda install -y -c conda-forge -c bioconda -c AgBiome python=3.10 spades fastp -n Genomics
# Instalar otros ambientes
conda create -c bioconda -c conda-forge quast -n quast -y
conda create -c conda-forge -c bioconda -c defaults prokka -n prokka -y
conda create -n checkm2 -c bioconda -c conda-forge checkm2 -y
Para MAC
/bin/bash -c "$(curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/HEAD/install.sh)"
conda create -n fastqc
conda activate fastqc
brew install fastqc
conda create -n Genomics
#Instalar paquetes en el ambiente
conda install -y -c conda-forge -c bioconda -c AgBiome python=3.10 fastp -n Genomics
conda install y -c conda-forge -c bioconda -c AgBiome python=3.10 spades -n Genomics
conda deactivate
conda create -n prokka
conda activate prokka
brew install brewsci/bio/prokka
conda deactivate
conda create -n quast
conda activate quast
brew install quast
conda deactivate
conda create -n checkm2 -c bioconda -c conda-forge checkm2 -y
Descargar base de datos
Este comando puede tardar un rato
mkdir ~/databases
conda run -n checkm2 checkm2 database --download --path ~/databases
Descargar los datos
#cree una carpeta llamada clas, dónde ejecutaremos todo
mkdir clase
#Muévase a la carpeta con el comando cd
cd clase/
#Descargue los datos a utilizar
pip install gdown
gdown --folder 104Tl8ou0AFPWXpn5BII_3H9a7BJeXGgU?usp=sharing
mv Data 01.Data
cd 01.Data
Si tiene MAC debe descargarlos manualmente con el siguiente link de google drive
Evaluación de la calidad de los reads
Utilizaremos Fastqc que es un programa que sirve para evaluar la calidad de las secuencias.
#Activamos el ambiente fastqc
conda activate fastqc
#Debe crear la carpeta 02.fastqc para que el programa se ejecute correctamente
mkdir ../02.fastqc
fastqc *.fastq.gz -o ../02.fastqc
Los archivos estarán en su computadora en una ruta similar a “\wsl.localhost\Ubuntu\home\user\Data\fastqc_results" reemplace su usuario. Abra el archivo en formato html
Control de calidad con fastp
Utiliazremos el parámetro “detect_adapter_per_pe” para detectar si hay residuos de adaptadores de secuenciación y el “- 30” para eliminar secuencias con calidad menor a 30 según el valor de calidad. Cree la carpeta fastp en el home antes de ejecutar el comando.
#Debe crear la carpeta "../03.fastp", inténtelo.
conda deactivate
conda activate Genomics
mkdir ../03.fastp
for i in `ls *_1.fastq.gz | sed 's/_1.fastq.gz//'`; do fastp -i $i\_1.fastq.gz -I $i\_2.fastq.gz --detect_adapter_for_pe -o ../03.fastp/$i\_1.fq.gz -O ../03.fastp/$i\_2.fq.gz -h ../03.fastp/$i\_fastq.html -e 30; done
Ubique los nuevos contis con los comandos cd y ls :)
Ensamblaje de novo con Spades.
Utilizaremos los parámetros “–only-assembler” para que no haga corrección de errores en los reads y los valores de k= 33 y 55 para que sólo haga el ensaamblaje con esos dos valores. Debe ajustar el valor de m según la memoria RAM de la que disponga. Por ejemplo si su computadora tien 16 entonces coloque 14, deje unos 2gb para que no muera. Si cree que su compu es muy lenta use únicamente -k 55
#Ejecute el siguiente comando para el ensamblaje.
spades.py --isolate -m 14 -1 ../03.fastp/A208b_1.fq.gz -2 ../03.fastp/A208b_2.fq.gz -k 33,55 -o ../04.ASSEMBLY_SPAdes/
El ensamblaje queda guardado en la carpeta 04.ASSEMBLY_SPAdes/ y es un archivo llamado contigs.fa. Búsquelo con los comandos cd y ls :)
Renombre el archivo contigs.fasta, puede utilizar el nombre A208b.fasta (pista, utilice el comando mv)
Utilizaremos Quast para visualizar las métricas de calidad del ensamblaje
conda deactivate
conda activate quast
quast.py A208b.fasta -o ../05.QUAST/A208b
Si han llegado hasta acá, estoy muy orgulloso!
## Anotación con Prokka
Utilizaremos Prokka para ver los genes anotados
```yml
conda deactivate
conda activate prokka
prokka --outdir ../06.Prokka --prefix A208b A208b.fasta
Checkm2
Determinar contaminación y completitud del genoma
conda deactivate
conda activate checkm2
mkdir fastas
mv A208b.fasta fastas/
checkm2 predict --input fastas --output-directory ../07.checkm2 -x fasta --threads 8 --database_path ~/databases/CheckM2_database/uniref100.KO.1.dmnd --force
OPCIONAL: Phylogenomics made easy
Vamos a ejecutar GenFlow, que nos da como output un árbol filogenómico con un sólo comando. Sorry, no lo he estandarizado para MAC :(
#Descargue el repositorio del github
cd #esto los devuelve al home
git clone https://github.com/braddmg/GenFlow.git
#Muévase a la nueva carpeta
cd GenFlow
#Crear un nuevo ambiente utilizando un archivo de configuración
conda env create -f GenFlow.yml
conda deactivate
conda activate GenFlow
#Ejecutar la configuración del script
bash setup.sh
#Reinicie el ambiente y pruebe que todo funcione con el comando GenFlow
conda deactivate
conda activate GenFlow
GenFlow -h
Si se muestra el mensaje de help, entonces la instalación funcionó sin problemas.
En la carpeta 01.Data hay un archivo que se llama “references.txt” este tiene una lista de códigos que usaremos como genomas de referencia.
#Cree una nueva carpeta
cd ~/clase
mkdir 07.Phylogenomics
#Mueva el archivo con la lista de genomas
mv 01.Data/references.txt 07.Phylogenomics/
#Mueva su genoma a la misma carpeta
cp 04.ASSEMBLY_SPAdes/A208b.fasta 07.Phylogenomics/
cd 07.Phylogenomics/
Una vez dentro de la carpeta 07.Phylogenomics revise si ya tiene los archivos (el fasta y el txt) con el comando ls. Y ejecute el comando GenFlow.
GenFlow -g references.txt -f A208b.fasta -t 12 -G 0.8 -F 0.8
cd results/
ls
En la carpeta results, debe tener un archivo .tree y varios archivos .svg que son los heatmap con los valores de ANI.
El archivo .tree puede visualizarlo en la página de iTOL.
Uso del Kabré
Muy bien! Ahora intentemos hacerlo en el servidor del CENAT
Abra windows powershell en su computadora (no es necerio que sea wsl) o la aplicación MobaXterm
Ejecute el siguiente comando reemplazando su usuario. Automáticamente se le solicitará su contraseña y al digitarla no aparecerá en la pantalla por una cuestión de seguridad. Cuando termine presione enter.
ssh -p 22022 user@cluster.cenat.ac.cr
Utilice el siguiente comando para copiar los datos a su carpeta
cp /work/bmendoza/ejemplo ejemplo
Convertir archivo bam a fastq
Por algún motivo PacBio envía el archivo en fomato BAM, por lo que hay que convertirlo a fastq.
Revise que se haya creado la carpeta “ejemplo” y muévase dentro de ella.
#Convertiremos el archivo bam a fastq
samtools fastq m64268e_240324_144300.subreads.bam > A208b_PacBio.fastq
Visualización de archivos .slurm
En su carpeta hay varios archivos en formato slurm. Estos los utilizaremos para enviar trabajos remotos de cada programa.
Ejecute el primer archivo llamado fastp.slurm
cat fastp
sbatch fastp.slurm
#Podemos revisar el proceso de nuestro trabajo con el siguiente comando:
squeue
Una vez termine nuestro trabajo, podemos abrir el archivo fastp.txt con el comando cat. Este contiene los resultados.
Ensamblaje híbrido
Revise el archivo llamado SPAdes.slurm. Entiéndalo antes de enviarlo.
cat SPAdes.slurm
sbatch SPAdes.slurm
squeue
Evaluación de la calidad con Quast
Evaluación de contaminación
Finalmente utilizaremos checkm2 para evaluar la presencia de contaminación en la muestra.
cat checkm2.slurm
sbatch checkm2.slurm
squeue
cat checkm2.txt